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繼發(fā)性登革熱IgG捕捉法檢測試劑盒

檢測程序

注： 確保所有試劑在開始測定前平衡至室溫（20-25℃）。在所給時間和溫度范圍以外進行測試可能產(chǎn)生無效的結(jié)果。不在預(yù)定時間和溫度范圍內(nèi)的測試必須進行重復(fù)。

ELISA程序

• 從鋁箔袋中取出所需數(shù)量的微孔板并插入測試條槽。陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品和校準品各需5個微孔，一式三份。確保剩下未使用的微孔密封于鋁箔袋內(nèi)。
• 使用適當?shù)脑嚬芑蛭⒌味ò逑♂岅栃再|(zhì)控品（P）、陰性質(zhì)控品（N）、校準品（CAL）和患者樣本。
  • 混合10μL血清與1000μL樣本稀釋劑?；旌暇鶆?。 

或者，

• 混合10μL血清與90μL樣本稀釋劑。取出20μL稀釋血清，加入180μL樣本稀釋劑?；旌暇鶆?。

• 吸取100 µL樣本稀釋劑、質(zhì)控品和校準品添加至對應(yīng)的微孔中。
• 蓋住測定板并在37°C ± 1°C孵育30分鐘。
• 用稀釋后的清洗緩沖液洗6次（參考清洗程序）。
• 吸取100 µL HRP標記抗人IgG添加到每個微孔中。
• 蓋住測定板并在37°C ± 1°C孵育30分鐘。
• 用稀釋后的清洗緩沖液洗6次（參考清洗程序）。
• 吸取100 µL TMB添加到每個孔中。
• 在室溫（20-25℃）下孵育10分鐘，從第①次添加開始計時。藍色將會顯現(xiàn)。
• 按照相同順序吸取100μL終止液添加到每個孔中，計時同TMB添加步驟?；旌暇鶆颉Ｋ{色將變成黃色。
• 在30分鐘內(nèi)讀取每個孔在450nm波長的吸光度，參考濾波器為600-650nm。

注： 如果使用雙波長分光光度計，將參考濾波器設(shè)定在600-650nm之間。在沒有參考濾波器的情況下讀取450nm的微孔結(jié)果可能由于背景原因?qū)е挛舛绕摺?/span>

清洗程序

為了清除未復(fù)合的樣本或成分，有效清洗是ELISA程序的關(guān)鍵步驟。

A.自動洗板機

• *抽凈所有微孔。
• 在清洗循環(huán)期間將每個孔裝滿至邊緣（350μL）。
• 完成6次清洗后，將測定板倒立于吸水紙巾上用力敲打，確保清除所有清洗緩沖液。
• 為了確保有效清洗，必須維持自動洗板機良好的保養(yǎng)。必須始終遵守廠商的清潔說明。

B.手動清洗

• 將測定板的內(nèi)含物丟棄到適當?shù)膹U物容器。
• 用適當?shù)臄D壓瓶將微孔填滿清洗緩沖液。避免清洗緩沖液起泡，否則會降低清洗效率。立即丟棄微孔里的清洗緩沖液。
• 再將微孔填滿清洗緩沖液，并立即丟棄。
• 重復(fù)步驟（3）4次，共用清洗緩沖液清洗六（6）次。
• 后一次清洗完成后，丟棄微孔的內(nèi)含物并將測定板置于吸水紙巾上敲打，以確保清除所有清洗緩沖液。

質(zhì)量控制

每個試劑盒包含校準品，陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品。這些組成的可接受值參見附帶的規(guī)格表。陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品用于監(jiān)測重大的試劑失敗。陽性質(zhì)控品不能確保測定臨界值的精密度。如果質(zhì)控品或校準品的任一吸光度讀數(shù)不符合規(guī)定，則測試無效且應(yīng)重新測試。如果測試無效，則不能報告患者結(jié)果。必須按照地方、州和/或聯(lián)邦法規(guī)或認證要求以及實驗室標準QC程序執(zhí)行質(zhì)控（QC）要求。有關(guān)適當?shù)腝C操作規(guī)程指南，建議用戶參考CLSI C24-A和42 CFR 493.1256。

預(yù)期值和測試局限性

• 必須結(jié)合患者的臨床體征和癥狀來做臨床診斷。該試劑盒的結(jié)果本身并沒有診斷作用，應(yīng)該與其他臨床數(shù)據(jù)和患者癥狀聯(lián)用。
• 陽性預(yù)測值取決于病毒存在的可能性。只能檢測有臨床癥狀或疑似接觸過相關(guān)病毒的患者。
• 黃病毒屬內(nèi)的血清型交叉反應(yīng)（登革熱1、2、3、4，日本腦炎，西尼羅河病毒，墨累山谷腦炎等）在IgG， 水平上十分常見^3,4,5。在東南亞進行的試驗表明90%的日本腦炎患者（n=20）的IgG間接結(jié)果大于10 Panbio單位。
• 利用地方人群測定了臨界值。 人群血清流行病學在不同地理區(qū)域應(yīng)該隨時間而變化。終，臨界值需要根據(jù)對當?shù)氐难芯窟M行調(diào)整。
• 尚未確定目測結(jié)果判定的性能特征。
• ELISA篩選試驗結(jié)果表明登革熱感染的所有血清必須送到參考實驗室進行陽性確認和流行病學記錄。

性能特征

用Panbio Dengue IgG Indirect ELISA對386份經(jīng)過血凝抑制試驗（HAI）和ELISA方法的回顧性血清進行檢測。這些血清包括來自以下組別的樣本：108份血清陰性樣本、84份原發(fā)性樣本、94份繼發(fā)性樣本和100份地方性樣本。 通過Panbio Dengue IgG Indirect ELISA 對這些血清樣本進行檢測并將其結(jié)果與血清的登革熱感染狀態(tài)進行對比，從而確定檢測的靈敏度、特異性和一致性。數(shù)據(jù)總結(jié)于表1。  

馬來西亞的一所大學通過基于世界衛(wèi)生組織（WHO）標準的HAI試驗將115份血清樣本確定為原發(fā)性或繼發(fā)性登革熱感染。 該試驗組由23份原發(fā)性和92份繼發(fā)性登革熱樣本構(gòu)成。

繼發(fā)性登革熱IgG捕捉法檢測試劑盒